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              案例與資料

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              基于靶向PRL磷酸酶三聚體的新型抗癌藥物發現
              日期: 2019-09-26 18:58 瀏覽: 2171

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              IF8.4

              研究思路:靶點結構分析,數據庫虛擬篩選,激酶活性實驗,細胞實驗、化合物結構優化、體外實驗驗證,體內實驗,分子水平作用機制,藥物作用模式分析,作用機制實驗。


              背景

              再生肝磷酸酶(PRL)癌蛋白是在多種腫瘤組織中過度表達的磷酸酶。PRL水平升高與腫瘤的轉移和不良的臨床結果有關。理論上,PRL磷酸酶可以提供有效的治療靶點,但由于缺乏特異性靶向它的化合物,PRL磷酸酶在腫瘤治療上仍然沒有得到足夠的利用。


              目的

              PRL磷酸酶是通過三聚體來發揮利用,利用這種獨特的性質,借助虛擬篩選和藥物化學的方法,尋找能夠破壞這種三聚體結構的化合物,從而抑制PRL磷酸酶的活性。通過體外和體內實驗,驗證化合物的抗腫瘤效果。


              方法

              虛擬篩選:從ZINC database中,篩選能與PRL1單體間界面結合的化合物。分兩步對接,剛性對接(DOCK6.2),柔性對接(圖1A、B)。

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              1 PRL1三聚體結構(A)及虛擬篩選流程(B

              激酶活性實驗:體內、體外。

              細胞實驗:劃痕實驗、細胞遷移實驗。

              化合物結構優化:細胞遷移實驗驗證。

              體外實驗驗證:構建表達 PRL磷酸酶的細胞和表達三聚體缺陷PRL磷酸酶的細胞。細胞遷移實驗驗證。

              體內實驗驗證:小鼠實驗,表達PRL磷酸酶的小鼠和PRL磷酸酶缺失小鼠的胚胎成纖維細胞。

              分子水平作用機制:PRL 1通過激活ERK 1/2AKT途徑促進細胞增殖和遷移,探究化合物對ERK 1/2AKT途徑的影響。

              藥物作用模式分析:驗證化合物作用于PRL的三聚體界面。

              作用機制實驗:黑色素瘤TCGA表達數據驗證PRL 1的促癌作用,體外和體內實驗驗證化合物的抑癌機制。


              研究成果

              經兩步虛擬篩選后,得到56 hits,體外和體內激酶實驗,篩選到3個化合物(圖2C)能夠顯著降低細胞內PRL1三聚體的形成,其中Cmpd-43最顯著(圖2D)。Cmpd-43對細胞的侵襲和遷移也有一定的抑制作用(E、F

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              2 3 hitsC)、體內激酶試驗(D)細胞實驗(E、F


              Cmpd-43結構進行優化,得到7個類似物(圖3A),細胞的遷移實驗表明,類似物 -3顯示出與CMPD-43相似的效果,而類似物24-7似乎比CMPD-43略小。但是類似物-1對細胞增殖或遷移沒有影響,這表明在類似物-1中缺失的亞氨基甲基芳族部分對PRL1三聚體抑制活性是關鍵的(圖3B)。

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              3 Cmpd-43及其類似物對細胞增殖或遷移的影響


              表達 PRL磷酸酶的細胞促進了細胞的增殖和遷移,而表達三聚體缺陷PRL磷酸酶的細胞增殖和遷移能力和對照細胞相似,說明PRL磷酸酶的三聚體結構在促進細胞增殖和遷移中扮演重要的角色(4 A、B)。用Cmpd-43和類似物-1處理表達 PRL磷酸酶的細胞和表達三聚體缺陷PRL磷酸酶的細胞。Cmpd-43能抑制表達 PRL磷酸酶的細胞,其余的處理組均沒有抑制效果(圖4 C)。小鼠實驗也證明,Cmpd-43能抑制表達 PRL磷酸酶的細胞,而對PRL磷酸酶缺失的細胞無影響(圖4 D)。WB實驗驗證,CMP D-43(5 mmol/l)能特異性抑制Prl 1介導的HEK 293細胞ERK 1/2AKT通路的活化。

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              4 Cmpd-43及類似物-1對表達PRL磷酸酶/PRL磷酸酶缺陷細胞的影響


              為了驗證Cmpd-43是作用于PCL的三聚體界面,從而發揮抑制作用,我們將類似物-3Cmpd-43分別與PRL磷酸酶共結晶,得到了類似物-3結合的PRL1的共晶體,通過結合模式的分析,發現類似物-3確實是與PCLBC界面結合,并且與周圍的氨基酸殘基作用形成了穩定的構象(圖5 ABC)。類似物-3 Tyr14 and Phe132具有較強疏水性接觸,而對二聚體界面結合表面的分析表明,這兩種殘基對三聚體形成的貢獻十分有限,因此推測,這兩個殘基突變會影響類似物-3PCL的結合,但是不會影響PCL的三聚體結構。我們對Tyr14 and Phe132進行了Ala替換。 結果發現,用Ala取代bar 14ph 132PCL三聚和PCL介導的細胞遷移沒有影響(圖5 DE),并且突變體對Cmpd-43呈現出抗性。這些結果表明類似物-3Cmpd-43是結合在PRL三聚體界面并防止PRL三聚反應。

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              5 類似物-3Cmpd-43結合到PRL磷酸酶三聚體界面并阻止PRL三聚結構形成


              黑色素瘤TCGA表達數據驗證PRL 1的促癌作用(圖6 ABCCmpd-43能抑制人黑色素瘤細胞的增殖和遷移(圖6 DE)。Cmpd-43也能降低HGF誘導的Erk1/2Akt磷酸化(圖6FG)。除了PRL 1,PRL 2PRL 3也能形成三聚體結構,通過敲除起主要作用的PRL 1PRL 2,發現細胞的ERK1/2 and Akt通路受到抑制(HI),說明Cmpd-43能夠同時抑制PRL 1,PRL 2PRL 3的活性。

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              6 Cmpd-43對黑色素瘤細胞系MeWo.具有抑制作用


              黑色素瘤小鼠模型實驗,再次驗證Cmpd-43通過抑制ERK1/2 and Akt通路,起到抑癌作用(圖7)。


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              7Cmpd-43在體內抑制黑色素瘤移植瘤的生長



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